Kas ir peptīdu sintēze

 

Peptīdu sintēze ir aktīva olbaltumvielu un peptīdu ķīmijas joma, kas parasti ietver secīgu aminoskābju pievienošanu noteiktā secībā, lai ar ķīmiskām metodēm izveidotu peptīdu ķēdi. Galvenās sintēzes metodes ir šķidrās fāzes un cietās fāzes sintēze. Salīdzinot ar LPPS, SPPS priekšrocības ir ātrākas, vienkāršākas, ar mazākām blakusreakcijām un augstāku ražu.

 

Standarta SPPS metode, tostarp Boc (benzils) un Fmoc (tBu) stratēģijas.

 

 

Boc (benzils) stratēģija

Šajā sintēzes pieejā kā cietie nesēji tiek izmantoti hlormetilēti, hidroksimetilēti polistirola un p-metoksibenzila (PMA) sveķi. -aminogrupa ir aizsargāta ar t-butoksikarbonilgrupu (Boc), savukārt aminoskābju sānu ķēdes grupas ir aizsargātas ar benzilatvasinājumiem. Boc grupa tiek noņemta, izmantojot tīru TFA vai TFA CH2Cl2, un sintēzes beigās sānu ķēdes aizsarggrupas un peptīdu-sveķu saites tiek noņemtas ar spēcīgu skābi, piemēram, bezūdens fluorūdeņražskābi (HF) vai TFMSA.

 

Fmoc (tBu ) stratēģija

Šajā sintēzes pieejā kā cietie nesēji tiek izmantoti Wang-sveķi, 2-hlortritilhlorīda sveķi, Rink amīda-AM sveķi, Rink amīda-MBHA sveķi. -aminogrupa ir aizsargāta ar 9-fluorenilmetoksikarbonilu (Fmoc). ), savukārt aminoskābju sānu ķēdes grupas ir aizsargātas ar skābēm labilām aizsarggrupām. Fmoc grupa tiek noņemta, izmantojot 20% piperidīna DMF, un sintēzes beigās sānu ķēdes aizsarggrupas un peptīdu-sveķu saites tiek noņemtas ar 1% -95% TFA. Fmoc SPPS pašlaik ir vēlamā peptīdu sintēzes metode.

 

Fmoc cietās fāzes peptīdu sintēzes pamatprincipi

 

Izvēlieties Sveķi

Visplašāk izmantotie sveķi Fmoc SPPS, tostarp 4-alkoksibenzilspirta (Wang) sveķi, 2-hlortrilhlorīda sveķi, Rink amīda sveķi, Rink amīda-MBHA sveķi. Amīda sveķus izmanto peptīdu sintēzei ar nepieciešamo C termināla amidēšanu. Wang sveķus un 2-Cl Trt sveķus parasti izmanto peptīdu sintēzei ar nepieciešamo C terminālu bez COOH. Bet, ja peptīda C-galā kā pirmā aminoskābe ir Pro un Gly, Vanga sveķus nevajadzētu izmantot DKP (diketopiperazīna) veidošanās riska dēļ, 2-ieteicams lietot hlorotritilhlorīda sveķus.

 

 

Aizsargāto aminoskābju pievienošana sveķiem

Pirmā Fmoc aminoskābe ir pievienota nešķīstošam atbalsta sveķiem, izmantojot skābes labilu saiti.

 

-aminoaizsardzības grupas noņemšana

Pagaidu Fmoc aizsarggrupa peptidil-sveķu N-galā tiek noņemta, apstrādājot to ar 20% piperidīna šķīdumu DMF. Šī reakcija parasti beidzas 10 līdz 20 minūšu laikā.

 

Mazgāšanas soļi

Pēc katras ķīmiskās reakcijas tiek veiktas mazgāšanas darbības, lai no sveķiem noņemtu liekos reaģentus, blakusproduktus un neizreaģējušās molekulas. Tas palīdz saglabāt augošās peptīdu ķēdes tīrību.

 

Aizsargātās aminoskābes aktivizēšana un savienošana

Aizsargātā aminoskābe, kas saistīta ar sveķiem, tiek aktivizēta, lai uzlabotu tās reaktivitāti savienošanai ar nākamo aminoskābi secībā. Parastie aktivējošie līdzekļi ir HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU un HATU. Savienošana ietver peptīdu saites veidošanu starp aktivēto aminoskābi un augošās peptīdu ķēdes aminogrupu. Kaizera testu parasti izmanto, lai uzraudzītu savienojuma reakciju pilnīgumu.

 

Mazgāšanas soļi

Līdzīgi kā iepriekšējos mazgāšanas posmos, tas nodrošina lieko reaģentu un blakusproduktu noņemšanu pēc savienošanas reakcijas.

 

Atdalīšana no sveķiem un sānu ķēdes aizsarggrupu noņemšana

Kad vajadzīgā peptīdu secība ir sintezēta uz sveķiem, tā tiek atdalīta no cietā nesēja, izmantojot šķelšanās kokteili, piemēram, trifluoretiķskābi (TFA), kas satur uztvērējus, piemēram, tioanizolu un ūdeni. Vienlaikus tiek noņemtas sānu ķēdes aizsarggrupas uz aminoskābju atlikumiem, atklājot pilnībā noņemto peptīdu, kas ir gatavs attīrīšanai un analīzei.